Gli spike-in sono mix di piccole sequenze nucleotidiche aggiunte all’RNA totale prima di iniziare il protocollo di library prep.
Sono costituiti da 7 oligo contenenti ciascuno una sequenza univoca di 13 nucleotidi compresa tra basi randomizzate.
Hanno due funzioni principali: innanzitutto, servono da controllo per le performance quantitative del saggio in corso, in secondo luogo permettono la normalizzazione dei dati sequenziati, convertendo il numero di letture in numero di copie per microlitro.
Quest’ultimo aspetto è molto importante perché i prodotti del sequenziamento di smallRNA da fluidi biologici spesso sono difficili da quantificare, rendendo potenzialmente inefficaci metriche quali le RPM (reads per million). Esprimendo i risultati in unità assolute, gli spike-in permettono una comparazione più precisa tra diversi esperimenti.
Gli spike-in possono essere utilizzati nei protocolli di library prep NEXTFLEX e sono compatibili con un vasto numero di specie e matrici, inclusi plasma, siero, urine, fluidi cerebrospinali, liquidi sinoviali, cellule, tessuti, vescicole extracellulari, ecc.